16s 测序
几十年来，16S rRNA基因一直是基于序列的细菌分析的基石。
16S rRNA 基因是识别复杂群落中微生物的快速灵验璀璨，因此已被用于东说念主类微生物组计议 (HMP) 、地球微生物组计议 (EMP) 和东说念主类肠说念宏基因组学 (MetaHIT) 等盘考。
该基因的一大上风在于，其分析顺次不依赖于样本中细菌的可培养性，不错笃定样本中总共细菌的相对品貌。此外，它大要同期对数百至数千样本进行并行测序，并在采样后最短两天内即可得回收尾。
基于二代测序的16S可变区域和基于纳米孔测序的全长的16S核糖体RNA (rRNA)测序，是微生物基因组学的中枢本领，平凡应用于针对16S rRNA基因特定区域的细菌和古细菌群落分析。
二代测序平台和华大DNBSEQ测序平台（特别关切V4或V3V4区域），以及基于纳米孔本领的全长16S测序，是该范围的两种主要顺次。这些顺次在功能、应用和局限性上存在显耀互异，为微生物各样性和分类学提供了互补的认识。
二代测序平台以其高通量和高碱基准确性着名，大要高效生成约300至500个碱基对（bp）的短读段，往往粉饰16S rRNA基因的1-2个区域。这种读段长度和分类分辨率之间的均衡使其成为泥土、水体及东说念主类微生物组等多种环境和临床盘考的可靠弃取。
基于二代测序的16S 可变区具备更低的老本，更高的通量，但因其序列较短，在种水平的分辨率并不高。不外由于其已应用于大批的盘考，因此有着平凡的盘考样本数据和队伍累积，对于基于16S菌群数据的疾病和代谢机器学习和模子更为合乎。
同期，改善引物的通用性和减少单分子诞妄擢升16S rRNA测序效力。以东说念主体肠说念菌群应用为例，谷禾投合宏基因组数据和已有的菌群组成数据，通过算法大幅提高了V4区数据的物种分辨率，达到约70%的种扎眼比例。此外，谷禾还通过加多靶向引物，针对病毒、真菌、寄生虫及部分难以永别的16S病原菌开拓tNGS顺次，从而显耀膨胀了二代测序在微生物各样性检测范围的应用范围。
基于纳米孔测序的全长16S rRNA基因测序，尤其是选拔牛津纳米孔本领（Oxford Nanopore Technology, ONT）进行的测序，大要粉饰总共高变区（V1-V9）。该本领在物种层面上提供了更高的分类学分辨率，适用于病原体的快速会诊和辨别。但是，这一本领雷同面对序列准确性较低的挑战，况兼需要为长读段数据分析量身定制先进的生物信息学器具。此外，由于全长扩增对样本色量的条目较高，该顺次可能不合乎某些低品貌或高度混浊的样本。
刻下，高通量测序数据的爆炸式增长，促使对新的生物信息学器具及数据料理和分析战略的开拓。这种快速膨胀鼓动了分类学顺次和卑鄙分析本领的更动，进一步巩固了测序本领在当代微生物学盘录取的中枢肠位。跟着东说念主工智能（AI）本领的发展以及大批微生物测序数据的累积，投合特定范围的菌群数据与AI可为微生物群落外的疾病和代谢等问题提供新的认识。始终以来，通过二代测序累积的大批样本和数据，已成为其热切的应用上风。
核糖体RNA（rRNA）细胞中有三种热切的 RNA：
rRNA： 核糖体RNA（ribosomal RNA） mRNA：信使RNA（messenger RNA） tRNA：转运RNA（transfer RNA）核糖体RNA 是细胞中发现的分子，参与细胞器卵白质的合成，扩散到细胞质中。这有助于将 mRNA中包含的信息翻译成卵白质。
这些分子是在核仁中产生的，核仁看起来像是细胞核中一个密集的区域，其中包含编码 rRNA 的基因。这些编码的 rRNA 大小不一。至少每个核糖体包含一个大 rRNA 和一个小 rRNA。
核仁中的这两个 rRNA 与核糖体卵白投合，酿成核糖体的大亚基和小亚基。要知说念，核糖体卵白是在细胞质里合成的，然后一起迁移到细胞核，就在核仁里进行亚拼装。紧接着这些亚基又被送回细胞质去完成最终的拼装。
注：-50S是核糖体中较大的亚基，-30S是核糖体中较小的亚基。S是用来刻画核糖体亚基的相对大小和千里放慢度的单元。
古细菌和细菌中发现的 rRNA 有所不同，因为古细菌和细菌在真核细胞发育之前，就已从共同的前体平分离出来。
什么是 16S rRNA？16S rRNA 是编码细菌核糖体小亚基 RNA 的 DNA 序列。
16S rRNA 的功能
16S rRNA 是一种参与制造原核核糖体小亚基的 rRNA；它们是 30S 亚基（原核核糖体）的组成部分。
一般来说，它具有与较大亚基中的 rRNA 访佛的结构功能，将核糖体的卵白质保执在固定位置。它们还参与通过与较大亚基中的 23s rRNA 相互作用来促进小亚基与较大亚基的和会。古细菌、细菌、叶绿体和细菌中的小核糖体单元含有 16S。
对于 16S 中的“S”
16S 中的“S”是千里降总共，该指数暗意大分子在离心场中的下千里速率。
16S rRNA的基因本性
16S rRNA 基因是与细菌基因组中看到的 rRNA 编码细菌相对应的 DNA 序列。
这些是特异性的男女性爱图片，高度保守的；它们的基因序列鼓胀长。
细菌包含大要 1 到 几十个16S rRNA 拷贝，因此检测极其敏锐。16S rRNA编码基因的大小接近1500bp，包含50个功能结构域。
在原核生物中，核糖体 RNA 如下:
16S rRNA 基因的里面结构
16S rRNA基因里面结构包括保守区和可变区，不同细菌的通用引物可按保守区制定，特定细菌的特定引物可按可变区制定，16S rRNA不同区域的信息在种间存在变异，使得识别具有特异性。
16S rRNA 在卵白质合成中的作用
它们与 23S 相互作用，匡助整合两个核糖体亚基 (50S+30S)。3'端包含一个反向 SD 序列，用于投合 mRNA 的 AUG 密码子（肇端）。16S rRNA 的 3' 结尾与 S1 和 S21 的组合被以为与卵白质合成的肇熟察关。
核糖体卵白的固定可当作支架。因此，它们在笃定核糖体卵白的位置方面具有结构作用。
它安靖 A 位上准确的密码子-反密码子配对，从而在腺嘌呤残基的 N1 原子和 mRNA 骨架的 2′OH 基团之间酿成氢键。
16S rRNA测序跟着PCR本领的跳跃和核酸盘考本领的执续跳跃，16S rRNA基因检测本领已成为最平凡使用的菌群品貌识别和检测器具。
该本领可用于更快更准确地识别、分类和发现病原体。
一般rRNA基因测序触及以下标准：
DNA分离 加热以分离链和特定引物 哄骗 DNA 团聚酶蔓延引物 重叠上述标准，得回16S rRNA基因的多个拷贝 进行琼脂糖凝胶电泳，搜检家具的尺寸是否准确 PCR 产物纯化及测序在分子本领中使用核糖体RNA的一些公正是：
总共细胞中皆有核糖体 RNA 和核糖体 RNA基因是保守的 可用于刻画从未在实验室凯旋培养的新物种 是细菌物种大肆和分类的标准顺次 不错将细菌重新分类为全新的属或种 大肆细菌表型本领的一种低价而快速的替代顺次 一种顽强的遗传顺次，不错识别新的病原体 核苷酸探针用于大肆序列分析、系统发育分析、临床细菌、细菌的分子分类 快速，老本低，大范围样本组成和各样性 合乎构建大范围标准化样本数据库 16S rRNA | 扩增子测序在分类学分析中的总体精度16S rRNA 扩增子测序大要永别细菌或古细菌微生物物种，已成为盘考微生物组结构和各样性的“指纹”。
海量数据集标明，不同类型的栖息地中微生物组结构存在很大互异，导致微生物漫衍不均。举例，厚壁菌门和拟杆菌门在东说念主类肠说念菌群中占主导地位，而变形菌门和蓝藻则在当然环境中精深存在。不同的微生物在16S可变区上对扩增奢睿度和核苷酸序列可识别性有各自的偏好。因此不错通过优化变异区弃取、测序战略和读长等配置来进一步更动基于16S的分析。
WGS、三代全长测序
连年来，鸟枪法全基因组测序（WGS）和第三代全长16S rRNA扩增子测序本领使得在物种和菌株水平上对微生物组进行扎眼成为可能，同期对生物量、测序老本、分析时候和存储空间的条目也提高了1到2个数目级。
更热切的是，由于大批的微生物组已通过16S扩增子测序进行拜访（数千项盘考产生了突出500,000个样本，存储在Qiita、MSE和NCBI等通达存储库中），其中一些难以重新取样或重新测序（举例纵向队伍样本或从深海千里积物中荟萃的样本）。因此，对16S扩增子短读序列在分析中的应用进行全面评估以及不停更新和优化，对于先前数据的可重叠使用具有热切料想。
16S rRNA扩增子在微生物组盘录取的私有价值与再哄骗后劲
2023年，有盘考模拟扩增子产生和密切参考分类扎眼的通盘策画机模拟过程，以预计使用 16S rRNA 基因进行微生物组分析的性能。盘考突出 35,000 个物种的基因组和相应的 16S 片断，盘考发现扩增后的短读测序不错接近全长 16S rRNA 基因，与参考数据库进行序列比对，在物种水等分类中达到 73% 的准确率。
DOI: 10.1128/spectrum.00563-23
而且，发现16S V4区515F/806R引物组扩增效力最高，为81.72%（511,460个引物中有417,965个引物，如上）。
数据库方面
RefSeq弘扬出比其他两个数据库更好的比对率和精准度（在物种水平上）。而Greengenes和Silva的精度低主如果因为参考数据库中的扎眼不一致、不齐全，举例一些分类单元与海外原核生物定名端正（ICNP）不匹配，大批序列枯竭种致使属级别的扎眼。此外，盘考发现16S较长序列测序虽具有精度上风，但也存在因结尾兼并失败和测序诞妄率较高而导致的奢睿度耗费。
最好扩增区域
此外，以厚壁菌门和拟杆菌门为主的东说念主类肠说念微生物组的最好扩增区域是V4，但对于富含变形菌门和酸杆菌门的河流样本，V3区域效力更好。底下列表还包含只议论性能而不议论每个生境测序老本的替代决议，举例对于泥土，V4-V5 PE 250 bp序列在物种水平上的精度比V4 SE 150 bp序列更高，但也使老本更高（下表）。
DOI: 10.1128/spectrum.00563-23
扩增子可变区对β各样性花样的影响最大
详备的 alpha 和 beta 各样性分析还展示了从多种顺次中得出的分类学概况。16S V1、V3、V4 和 V5 区域的组成与实验遐想和 WGS 相似，而 V6 和 V7 与其他配置弘扬出弘大的互异。
收尾标明，扩增子可变区对β各样性花样的影响最大（Adonis R2 = 0.69，P < 0.01），其次是拷贝数改换（Adonis R2 = 0.15，P < 0.01），序列读长（Adonis R2 = 0.14，P < 0.01）和测序类型（Adonis R2 = 0.12，P < 0.01）。
Zhang W et al.,2023 Microbiol Spectr.
因此，通过合适的测序战略，扩增子不错在物种水平上以低老本提供接近WGS的可靠微生物组分析。
16S rRNA | 扩增子测序 vs 全长测序扩增子二代测序
二代测序，尤其是使用 Illumina 的 Novaseq 或华大基因的DNBseq 系统，由于其高碱基调用准确性和笼统量，已成为微生物分析的基石。
二代测序系统产生的300~500bp读长，足以粉饰 V4 区域的 515-806 片断，该区域以其可重叠性和分类准确性而着名。尽管有这些上风，V4 区域的长度有限也可能是一个污点。
为了缓解这种情况，测序顺次往往选拔经过修改的定制引物或加多测序深度等顺次来提高保真度，此外新的靶向测序决议也使得二代测序平台成为更具老本效益的决议。
优化和减少偏差
尽管有这些优点，二代测序和纳米孔测序本领皆有其局限性，包括由不同的引物组和测序平台引入的偏差。举例，盘考标明，纳米孔平台上的 V3-V4 区域引物可能弘扬出物种依赖性偏差，这可能并不合乎总共类型的微生物群落。针对这些问题，盘考东说念主员通过调遣PCR轮回次数、引物组和生物信息学责任历程来优化测序决议，从而提高微生物群落分析的可靠性和准确性。
16S全长测序
比较之下，纳米孔测序，尤其是使用牛津纳米孔本领 Oxford Nanopore Technologies (ONT) 平台，不错对全长 16S rRNA 基因进行测序，涵盖总共高变区 (V1–V9)。固然单碱基准确度较低，但概述来看物种分辨率更高。ONT MinION 等设立的便携性、老本效益和及时测序功能使其成为快速现场应用的联想弃取，举例会诊细菌感染和监测传染病爆发。
尽管纳米孔测序具有这些上风，但它也面对挑战：相对测序和建库老本更高，通量较二代测序更低，尾端数据质地的下落以及阻碍特意用于分析纳米孔 16S 序列的生物信息学器具和决议。对样本条目更高，可能不合乎部分低品貌或较多混浊的样本。
多项比较盘考标明，纳米孔本领不错在物种水平上识别微生物组成，其收尾与二代测序等其他测序本领的收尾相等相似，同期还不错识别出更多的细菌种类。
总体而言，在施行应用中，弃取二代测序也曾纳米孔测序取决于具体的盘考和应用谋略。
纳米孔测序更合乎于专注于物种级分类学分辨率、盘考稀薄分类群或提供丰富度的准确臆想的盘考。它还被阐扬不错灵验地对埃博拉和寨卡等病毒进行现场及时基因组监测。 二代16S扩增子测序仍然是满足高通量测序需求的顽强器具，特别是在处理大型数据集和扩增子序列变体的识别至关热切时。举例，Novaseq 和G99等平台不错产生非常数目的高质地 V4 读数，老本更低，使其成为现在盘考东说念主体微生物样本或微生态盘考的首选本领。克服挑战和截至
哥也色中文娱乐16S rRNA 测序固然功能顽强，但也存在一些固有的挑战和局限性。一个主要问题是由于细菌和古细菌 DNA 从极极少扩增而导致的混浊，使其容易受到无益环境细菌的影响。此外，与宏基因组测序顺次比较，16S rRNA 测序的老本效益和可及性所以数据较少为代价的。为处理这些问题而作念出的勤恳促成了新本领和新战略的开拓。引入独一分子璀璨符 (UMI) 为测序深度问题提供了潜在的处理决议。处理引物通用性和减少单分子诞妄亦然提高 16S rRNA 测序效力的要道。
针对东说念主体肠说念菌群应用
谷禾投合宏基因组数据和已有的菌群组成数据，通过算法不错大大提高扩增子数据的物种分辨率。此外病毒、真菌、寄生虫和部分16S难永别的病原菌现在通过加多靶向引物进行tNGS的神色来终了，大大拓展了二代测序微生物各样性检测范围的涵盖范围。
高通量测序数据的爆炸式增长，条目开拓新的生物信息学器具和数据料理和分析战略。这种快速膨胀导致了分类学顺次和测序数据卑鄙分析的更动，进一步巩固了测序本领在当代微生物学盘录取的作用。跟着AI和大批微生物测序数据的累积，特定范围的菌群数据投合AI不错提供菌群除外的疾病和代谢等问题的谜底，遥远以来二代测序累积的大批样本和数据变成一种热切的应用上风。
主要参考文件：
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Yeo K, Connell J, Bouras G, Smith E男女性爱图片, Murphy W, Hodge JC, Krishnan S, Wormald PJ, Valentine R, Psaltis AJ, Vreugde S, Fenix KA. A comparison between full-length 16S rRNA Oxford nanopore sequencing and Illumina V3-V4 16S rRNA sequencing in head and neck cancer tissues. Arch Microbiol. 2024 May 7;206(6):248.
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